Pyrosequencen is het een voor een in spuiten van nucleotiden. Wordt de desbetreffende nucleotide aan de 3' kant van de pyrosequenceprimer ingebouwd, dan komt pyrofosfaat vrij dat omgezet wordt door sulfurylase tot ATP. Luciferase zet de ATP onder invloed van luciferin om in een lichtsignaal (Fig 1). De PSQ 96 detecteert dit lichtsignaal en zendt deze informatie naar de computer die de gegevens verwerkt en analyseert (Fig 2). Niet ingebouwde nucleotiden zullen door apyrse worden afgebroken.

Alvorens een SNP getest kan worden zullen eerst de PCR -en Sequence primers geselecteerd worden en vervolgens de "nucleotide dispensation order". Deze worden respectievelijk geselecteerd met Primer3, Primer design (Pyrosequencing) en PSQ 96MA software. Vervolgens dient het PCR-product voorbewerkt te worden om het ds-DNA tot ss-DNA te maken (wordt uitgevoerd door de faciliteit). Dit kan geschieden d.m.v. Sepharosebeads of Dynabeads, waarbij Sepharosebeads techniek de voorkeur heeft gezien deze makkelijker te automatiseren is en de pieken bij pyrosequencen hoger en smaller zijn. Na toevoeging van de specifiek sequenceprimer wordt een denaturatie en een annealing stap uitgevoerd. Vervolgens worden in het apparaat (PSQ96MA) het substraat, een enzymenoplossing en de desbetreffende nucleotiden per well toegevoegd.